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酵母表面展示技术平台快速、高通量的发现纳米抗体

简介

酵母表面展示技术是一套应用于抗体发现、靶点发现及蛋白工程领域的通用技术。


在抗体工程中,利用酵母真核表达系统的特性,将抗体文库蛋白表达于酵母细胞表面,利用磁珠和流式细胞分选技术进行筛选,获得高亲和力或高稳定性的抗体序列。此项技术在各种骨架形式的抗体工程,如单链可变区scFv、抗体结合区片段Fab、全长IgG、骆驼科单域抗体可变区VHH,以及抗体亲和力成熟、抗体稳定性提升、pH稳定性等方面均有广泛应用。NBbiolab建立了成熟稳定的yeast display平台,能够方便且快速的发现纳米抗体。


原理

目前虽然已实现了多种酵母细胞株及多种细胞壁锚定点用来展示各种蛋白,但最常用的还是酿酒酵母α-凝集素。


α-凝集素由2个核心亚单位Aga1和Aga2组成。在该系统中,编码Aga1蛋白的基因稳定地整合到酵母染色体中,而将编码蛋白支架-Aga2融合蛋白的基因克隆到环状酵母展示质粒载体中,该质粒载体使用营养标记物选择性地维持在酵母中。诱导蛋白表达后,蛋白质支架表达为与Aga2蛋白的融合体,融合体Aga2蛋白再通过两个二硫键与α-凝集素Aga1蛋白共价连接形成共价复合物,并分泌至酵母细胞表面(图1)。Aga1和Aga2的表达均受半乳糖诱导型启动子的控制。由于表面展示是有条件的,而不是组成性的,因此可以表达潜在的细胞毒性蛋白支架,从而避免了由于这种支架的负选择而造成的文库偏倚。每个酵母细胞大约可以展示5万个蛋白-Aga2融合物,展示水平可能低或高取决于蛋白质支架的稳定性和溶解度。

Yeast display 原理与流程

图1Yeast display 原理与流程


对于酵母文库筛选,我们通常经验是采用流式细胞分选法或磁珠筛选结合流式分选的方法。免疫文库通常仅需1轮磁珠筛选结合1-2轮流式细胞分选,通过NGS测序就可获得多株多样性丰富且亲和力高的抗体序列,进一步对多个克隆进行鉴定,之后还可按要求进行多轮亲和力成熟提高性能。


技术优势

Yeast display 与 Phage display 相比,酵母表面展示具有以下显著优势:


1、 酵母具有类似于高等真核生物的分泌途径, 蛋白质折叠在内质网中,其中伴侣蛋白,折叠酶和质量控制机制确保仅分泌正确折叠的蛋白质。而噬菌体是原核系统,有些抗体对大肠杆菌有毒的克隆,其生长缓慢甚至不生长,导致文库的偏向与克隆的丢失。


2、通过噬菌体展示筛选更高亲和力的抗体时,通常会受到筛选处理过程的不利影响,不仅取决于亲和力,还取决于抗体表达水平。而酵母展示系统采用FACS分选技术,基于抗体亲和力及展示水平进行筛选,因此消除了表达引起的偏差,且能区分相差很小亲和力的克隆。


3、酵母展示是多价展示,能够一次通过Sorting直接分选高,中&低亲和力的克隆,非常方便。


4、通过使用双染色的 FACS,可以直接在酵母细胞表面上确定抗体亲和力,从而无需耗时的亚克隆、表达和纯化。


5、抗体筛选速度快,3min即可完成10万个细胞的分选,获得100+的unique sequence 候选克隆。


6、在相同的展示系统下可对抗体的亲和力和稳定性进行优化。


案例分享---NB154项目


1.羊驼免疫及血清检测

NB154项目抗原免疫四次Alpaca,每次间隔21天,三次boost后血清titer稳定,达到了128K。

Dilution Folds

2.构建酵母文库

分别采集A羊驼的三免及四免之后50mL外周血,分离PBMC。用RNAiso Plus试剂提取总RNA,取1μg RNA电泳,检测RNA纯度。


NB154 RNA电泳图

图3 NB154 RNA电泳图(A:三免后提取A羊驼总RNA;B:四免后提取A羊驼总RNA)


采用巢式PCR的方法,将VHH构建到酵母载体中,库容量为:1.2×108个。


库容量测定

图4 库容量测定(左:10-5转化子计数平板;右:10-6转化子计数平板)


随机从文库平板上挑取48个单克隆进行PCR鉴定,结果表明插入率为100%,测序结果表明无重复,多样性良好。

文库插入率检测

                                    图5 文库插入率检测


3.文库筛选与鉴定

第一轮采用磁珠进行富集:

磁珠1轮筛选产物染色后流式仪分析图谱见图6。

image.png

图6 磁珠1轮产物流式仪分析图谱(左:细胞密度图;右:柱状图,黄色为未染色对照细胞,红色为样品染色细胞)


第二轮采用流式分选仪分选结果(仪器Sony SH800s)。

流式分选仪分选图谱见图7,分选得到105个细胞。

image.png

             图7 流式分选仪分选图谱(设置O门为分选细胞群)


从图我们可以清晰的看出,抗体亲和力分为高中低三群,根据客户要求选择高与中亲和力抗体群进行分选,分选到96孔板中并采用流式分析仪(sony SA3800)进行单克隆鉴定。将随机选择192个阳性克隆送测序进行鉴定,共获得52条unique sequences。

克隆流式鉴定

克隆流式鉴定

                                                                     图8。部分克隆流式鉴定结果


文献报道的酵母表面展示应用案例

应用案例


酵母展示纳米抗体发现服务:

基于NBbiolab成熟的酵母展示纳米抗体研发平台,我们提供以下服务,欢迎咨询~

Yeast Display Library Construction Service

Yeast Display Library Screening Service


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